血清总胆固醇(TC)测定操作规程

血清总胆固醇(TC)测定操作规程 A1.2 原理

血清中的胆固醇酯(CE)被胆固醇酯水解酶(CEH)水解成游离胆固醇(Chol),后者被胆固醇氧化酶(CHOD)氧化成△4—胆甾烯酮,并产生过氧化氢,再经过氧化物酶(POD)催化4—氨基安替比林与酚(三者合称PAP) ,生成红色醌亚胺色素(Trinder反应) 。醌亚胺的最大吸收在500nm 左右,吸光度与标本中总胆固醇呈正比。反应式如下:

胆固醇酯+H2O CEH 胆固醇+游离脂肪酸 胆固醇+02 CHOD △4-胆甾烯酮十H202 2H202+4-氨基安替比林+酚 POD 昆亚胺+4H2O

A1.3 标本采集与处理

对于血脂分析,特别需要强调“分析前”各个环节的质量管理。

A1.3.1 受检者(体检对象或病人) 的准备:除总胆固醇不一定用空腹血外,测定甘油三酯、脂蛋白与载脂蛋白的病人必须空腹12h ,不饮酒24h 后采集血样。对于体检对象抽血前应有2周时间保持平时的饮食习惯,近期内体重稳定,无急性病、外伤、手术等意外情况。妊娠后期各项血脂都会增高,应在产后或终止哺乳后3个月检验才能反映其基本血脂水平。注意有无应用影响血脂的药物,如降血脂药、避孕药、噻嗪类利尿剂、β受体阻滞剂、免疫抑制剂、某些降压剂、降糖药、胰岛素及其他激素制剂等,检验以前应根据所用药物的特性停止用药数天或数周,否则应记录用药情况。对体检对象及做前瞻性观察者,还应注意采血的季节,因为血脂水平有季节性变动,为了前后比较应在每年同一季节检验。应嘱体检对象在抽血前24h 内不作剧烈运动。

A1.3.2 静脉采血:除非是卧床的病人,一般在采血时取坐位。体位影响水分在血管内外的分布,因此影响血脂水平。例如站立

5 min可使血脂浓度提高5%,15 min提高16%,故在采血前至少应***5min。一般从肘静脉取血,使用止血带的时间不超过1 min ,穿刺成功后立即松开止血带。静脉阻滞5min 可使甘油三酯增高10%~15%。

A1. 3.3 抗凝剂:我国多用血清作血脂检验。如用血浆,多主张用EDTANa2(1mg/mL) 抗凝。抗凝血浆中的总胆固醇和甘油三酯水平比血清中约低3%,EDTA 用量越多,血浆水平偏低越明显。但肝素抗凝不影响血浆中水平。

A1.3.4 标本处理:血标本应尽快送实验室。室温下放置30min ~45min 后离心分离血清或血浆,置洁净试管加盖保存。在室温中放置不超过3 h ,4C 保存可稳定4天。置-70'C 可长期保存,但不可反复冻融。 A1.4 试剂

A1.4. 1 酶试剂:本科使用XX 公司XX 产品号试剂盒,为干粉试剂。临用前用水复溶

即可使用。每瓶干粉用水XX ml 复溶。复溶后试剂内各主要成分如下:

磷酸盐缓冲液pH7.7 0.4mol/L

假单胞菌胆固醇酯水解酶 ≥800 U/L 奴卡氏菌胆固醇氧化酶 ≥400U/L 辣根过氧化物酶 ≥1000U/L

胆酸钠 3mmol/L

4—氨基安替比林 0.5mmol/L

酚 3.5mmol/L

聚氧乙烯表面活性剂 3g/L

A1.4.2 总胆固醇校准血清:也由XX 公司提供,产品号为XX 。

A1.4.3 试剂与校准血清的稳定性:未开瓶的试剂于4℃保存,可稳定至有效期。复溶的试剂在2℃~8℃可稳定7天,15℃-25℃可稳定3天。如在稳定期内试剂出现明显的粉红色,弃去不用o

A1.5 仪器, XX型号光电比色计,具500nm ~520nm 滤光片。

A1.6 操作

标本为及时分离的空腹血清,以及肝素或EDTA 抗凝血浆。本法为终点法。测定时标本管与标准管分别加入标本与标准血清各10uL ,酶试剂1.00mL ,混匀后在37℃放置5 min,或20℃~25℃放置10min 后用比色计比色,以试剂空白调零,波长500nm 或520nm ,颜色至少稳定60min 。

A.1.7 计算

A 测定

C= ×C0 -------------------------(A1) A 标准

式中:C ——测定血清总胆固醇浓度,mmol /L ;

A 测定——标本管吸光度;

A 标准——标准管吸光度;

Co ——校准血清中总胆固醇浓度,mmol /L ; A ,1.8 操作性能

A1.8.1 精密度:批内CV

A1.8.2 准确度:以参考方法(ALBK法) 定值的血清为校准品时,本法测定结果与ALBK 法基本一致。

A1.8.3 灵敏度:以酚为显色剂,总胆固醇为5.2mmol /L 时的显色吸光度A500nm 约0.30—0.35。

A1.8.4 可报告范围:血清与酶试剂用量之比为1:100时,测定上限为13 mmol /L 。 A1.8.5 特异性:血清中多种非胆固醇甾醇会不同程度地与本试剂显色。一般人血清中非胆固醇甾醇约占总胆固醇的1%,在常规测定时这种影响可以不计。

A1.8.6 干扰:血红蛋白高于2g/L时会引起正干扰;胆红素>170umol/L时有明显负干扰。抗坏血酸与甲基多巴血中浓度高于治疗

水平时也使结果偏低。高甘油三酯血症(血清混浊) 在本法中(血清与试剂量1:100时) 一般无明显影响。

1 本法为中华医学会检验学会推荐的总胆固醇测定常规方法(见中华医学检验杂志1995,18:185) 。

2 试剂中两种酶-胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的质量十分重要。必须能有效地水解各种脂肪酸的胆固醇酯(有些微生物来源的酯酶不易水解花生四烯酸酯) ,对胆固醇的氧化必须完全。选择试剂盒时应测试对血清标本总胆固醇的反应速度,好的试剂一般能在5min 内(有的只要1min ~2min) 反应达到终点。反应不能在10min 内完成的试剂不宜采用,其原因可能是原酶质量不好或酶用量太少,后者可使高胆固醇结果偏低。本法所用试剂,要求标本与酶试剂用量的比例为l :100,使可报告范围上限达13mmo1/L,过多地提高标本比例,会使测定上限降低。如果标本中总胆固醇浓度超过13mmol /L ,可

用生理盐水稀释后重新测定。现在临床很少要求做游离胆固醇测定,如需做游离胆固醇测定,最简便的也是酶法,即在上述总胆固醇试剂中省去酯水解酶;一般游离胆固醇约占胆固醇的30%左右。

3 总胆固醇测定要求标准化,与国际标准取得一致,必须有准确可靠的标准参考物质(SRM)。

1) 酶法测定总胆固醇时,血清中大部分胆固醇是酯化的,而且血清基体对酶反应有明显影响,不可使用纯胆固醇溶液为标准。国际上由美国国家标准与技术研究院(NIST)提供代号为SRM909的人参考血清,作为总胆 固醇测定的一级标准;我国也已建立了国家一级标准GBW 09138“人血清胆固醇标准物质”。常规使用的试剂盒必须具有可追溯于以上参考血清的校准血清,方能保证检验结果准确可靠。

2) 不可使用总胆固醇的定值控制品作标准。

3) 本法使用的校准血清为液态,用前必须充分混匀。

A1. 9 参考值

人群血脂水平主要决定于生活因素,特别是饮食营养,所以各地区调查所得参考值高低不一,应根据冠心病流行病学研究及临床经验统.一制定高胆固醇划分标准。欧美国家制定的标准大致相同,40岁以上人群总胆固醇水平高低的划分大致可定为: 合适水平

6.46mmol/L(201mg/dl~219mg/dl);

高胆固醇血症≥6.47mm01/L(≥220mg/dl)。 A1. 10 临床意义

影响总胆固醇水平的因素有:

A1.10.1 年龄与性别。总胆固醇水平往往随年龄上升,但到70岁或80岁后有所下降,

中青年期女性低于男性,50岁以后女性高于男性;

A1.10.2 长期高胆固醇、高饱合脂肪酸和高热量饮食可使总胆固醇增高; A1.10.3 遗传因素;

A1.10.4 其他。如缺少运动、脑力劳动、精神紧张等可使总胆固醇升高。

高胆固醇血症是冠心病的主要危险因素之

一。病理状态下高胆固醇有原发与继发的两类。原发的如家属性高胆固醇血症(低密度脂蛋白受体缺陷) 、家属性apo —B 缺陷症、多源性(polygenic)高总胆固醇、混合性高脂蛋白血症。继发的见于肾病综合征、甲状腺机能减退、糖尿病、妊娠等。

低总胆固醇血症也有原发的与继发的,前者如家属性的无β或低脂蛋白血症;后者如甲亢、营养不良、慢性消耗性疾病等。低总胆固醇者容易发生脑出血,也可能易患癌症(未证实) 。肝脏是胆固醇及卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)合成的器官,严重肝病病人

血清总胆固醇不一定很低,但由于血清卵磷脂胆固醇酰基转移酶活力低下,血清胆固醇酯占总胆固醇的比例可低达50%以下。 A1.11 参考文献

中华人民共和国卫生部医政司编.全国临床检验操作规程(第二版). 南京:东南大学出版社,1997.268


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