慢病毒包装操作说明

Clontech-Lenti-X Lentiviral Expression Systems User Manual

Protocol No. PT5135-1

慢病毒包装操作说明

A. 用Lenti-X HTX Packaging System生产慢病毒悬浮物

为了获得最高效价的病毒悬液,用Lenti-X 293T细胞系,严格尊守以下说明,尤其尊守(1)培养体系和培养量(2)DNA的量和转染质量(3)无四环素血清(4)孵育时间。

所有的Xfect转染成份,量和条件最好用Lenti-X Vectors,Lenti-X HTX 包装混合物,Lenti-X 293T细胞。用10cm组织培养板并确保血清无四环素,四环素污染的血清对表达包装成份是有害的。

所有的实验步骤均在无菌组织培养器血中完成。包装病毒需要有微生物安全等级2的生物安全柜中进行,注意重组的假性慢病毒包装颗粒能够感染人。

61. 转染24小时前,在10cm培养板接种4-5×10个293T细胞,添加10ml的生长培养基。

在37℃,5%CO2℃条件下过夜。在进行第7步前确保培养血有80-90%的覆盖率。

2. 充分混均Xfect Polymer。

3. 每个转染样品需准备两个离心管,按顺序添加如下试剂

Tube 1(Plasmid DNA) Tube 2(Polymer)

557µl Xfect Reaction Buffer 592.5µl Xfect Reaction Buffer 36µl Lenti-X HTX Packaging Mix 7.5µl Xfect Polymer

7µl Lenti-X Vector DNA(1µg/µl)

600µl 总量 600µl 总量

注意:Xfect Polymer 不要在室温下搁置长于30min

4. 充分混均每个管

5. 把Tube2添加到Tube1中,中速涡旋10秒。

6. 在室混下孵育DNA-Xfect混合物10min,这时可形成纳米复合物。

7. 把1200µl的DNA-Xfect溶液(第5步制备)加入到第1步准备好的细胞中,前后左右

轻轻晃动培养血,使其均匀。

8. 在37℃条件下培养。

9. 4小时或过夜后,换10ml的完全生长培养基,在37℃条件下在培养24-48h。病毒滴定

量在48h后可达到最高。注意:移弃的培养液包含了可感染的慢病毒。

10. 吸取慢病毒悬液。在500g下离心10min。注意:悬浮液包含可感染的慢病毒。

TM11. 用Lenti-X GoStix鉴定病毒产物或者滴定病毒株。然后可用病毒产物转导靶细胞。也

可在-80℃保存。

B:Lenti-Viruses转导靶细胞

1. 转导前12-18h,用完全生长培养基培养靶细胞

2. 轻轻混合冻融的病毒株或从细胞包装得到的病毒株,不要涡旋。需要提醒的是每次的冻

融都降低2-4倍的病毒效价

3. 根据靶细胞的培养液的量调节病毒和聚凝胺的添加量。在转导中可用足量的聚凝胺

(e.g.4µg/ml )来获得需要的最终浓度

4. 用细胞培养液稀释病毒株,获得需要的MOI。如要不知道病毒效价,可连续稀释病毒株

或包装悬液,使得用于转导的病毒总量不会超过病毒包装时培养液的1/3。

5. 在靶细胞中加入病毒悬液,转导8-24h。离心的培养液可以增加感染效率。

6. 移除丢弃存留病毒的转导培养液,换成新鲜的生长培养液。注意:移弃的培养液包含可

感染的慢病毒。

7. 继续培养细胞24-48h,在靶细胞中积累基因产物。

8. 收集细胞进行分析,或者用合适的抗生素再进行筛选。

注意:为了检测转导效率,可以选取少量细胞用抗生素处理。剩余的细胞可进行后续的分析。细胞进可能用完,但不要转导后少于24h内进行分析。


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