细菌基因工程

细菌基因工程

09生工2班

060509206

李赛赛

一、细菌基因工程的发展现状和趋势

1、细菌基因工程的发展简史

细菌与基因工程关系密切。细菌是单细胞、结构简单的原核微生物,目前对其生理代谢途径以及基因表达的调控机制研究较为透彻;细菌的物种和代谢类型多各多样,对环境因子敏感,易于获得各类突变株;并且细菌最显著的特征是生长速度快,便于大规模培养,容易朝廷遗传操作等。

1973年,波依尔和科恩首次完成外源基因在大肠杆菌中的表达,几年后,第一个基因工程产品——利用构建的基因工程菌生产人胰岛素获得成功,从此人类进入了生物技术的产业时代。

2、细菌基因工程的发展现状

1细菌工程菌与人类药物生产 ○

1982年美国首先将重组胰岛素投入市场,标志着世界第一

个基因工程药物的诞生。30年以来基因工程技术成果60%集中

应用于医药工业,为生物医药的发展带来一场崭新的革命。

未来市场前景广阔的药品将集中在单克隆抗体、反义药物、

基因治疗药物、可溶性蛋白质类药物和疫苗等5个类别中,其中单克隆抗体的市场需求最令人注目。

2细菌工程菌与环境保护 ○

利用环境微生物基因工程技术治理环境污染和遏制生态恶化趋势、促进自然资源的可持续利用,是一条最安全和最彻底的消除污染的行之有效的途径。

原理:主要是采用现代分子生物学和分子生态学的原理和方法,充分利用环境微生物的生物净化、生物转化和生物催化等特性的功能基因,构建高效表达的基因工程菌进行污染治理、清洁生产和可再生资源利用,多层面和全方位地解决工业和生活废弃物污染、石油和煤炭脱硫、农药残留、能源和材料短缺等问题。

优点:与化学、物理等其它技术相比,环境微生物基因工程技术具有效率高、成本低、反应条件温和以及无二次污染等显著优点,同时还可以增强自然环境的自我净化能力。 应用方面:工业和生活废水治理、重金属污染土壤的生物修复、农药残留的微生物降解、生物制浆和生物漂白等清洁生产技术的建立、石油污染的消除以及友好可再生材料的合成等诸多方面。

3细菌工程菌与食品、饲料及其他工业 ○

在发酵工业上,利用生物技术构建的品质优良的食用乳酸杆菌提高了生产菌在食品发酵过程中的稳定性,改善了发酵食品的质量并且降低了成本,大大缩短生产周期,具有巨大的经济价值和社会效益。酶制剂、氨基酸、维生素、增稠剂、有机酸、乳化剂、表面活性剂、食用色素、食用香精及调味料等,都可以采用发酵生产而得到。

4细菌工程菌与农业生产 ○

各类农业微生物的应用是实现农业可持续发展和保护生态环境的有力保证。

由于自然菌

株和传统技术本身的一些缺陷与不足,诸如研究周期长、成本高、活性低等,实现农业微生物的产业化受到很大限制。现代生物科学技术的发展给农业微生物研究注入了新的活力,特别是近年来基因工程的研究为微生物遗传改良提供了有效手段,使农业微生物发展成为生命科学领域中最为活跃、最具创新性的前沿之一。

二、细菌基因工程的表达系统

受体细胞的选择:

受体细胞的选择原则:

据所用载体体系及受体细胞的基因型进行选择;

重组体的转化或转染率高;

能够稳定遗传;

受体细胞基因型与载体所含的选择标记匹配;

易于筛选重组体;

外源基因可以高效表达和稳定遗传;

此外,安全性、导入方法、翻译及后加工机制和生产应用价值等。

基因工程的宿主细胞多种多样,但目前大多数重组DNA 技术生产的蛋白产品都是在大肠杆菌中合成的。

表达载体构建:

要使克隆的外源基因在宿主细胞中高效表达,首先需要构建专门的表达载体,用来控制转录、翻译、蛋白质稳定性以及克隆基因产物的分泌等。表达载体实际上是在克隆载体的基础上装载了用于表达的一些元件,当外源基因插入到合适的位点后,在宿主菌中就可以启动表达。目前大肠杆菌使用的表达载体种类繁多,形成了最成熟的表达系统。表达载体的选择主要体现在表达元件的选择和利用。对于克隆载体,只要满足在宿主菌中复制和选择要求的载体,都可以作克隆载体。

表达载体的构建是实现高效表达的关键步骤。一个完整表达载体包含必需的几个元件。

1启动子的选择:○启动子位于转录起始位点上游一10bp ~35bp ,受载体自身或宿主染色体相应的调节基因调控。一个理想的启动子需要具备如下特点:(1)具有强启动性,使重组蛋白达到菌体表达蛋白总量的10% ~30% ;(2)必须受调节基因严谨调控。(3) 启动子的诱导要求简便而廉价。通过基因工程手段表达外源基因的目的大致有2种,其一是超量表达,所以达到最大限度地获得蛋白质产物。如在大肠杆菌中常用lac 、tac 和T7等可调控强启动

子,在适当的条件下都可以使外源基因高水平表达。其二是使某个关键基因表达,使宿主菌表现出一种特殊的性状,或启动其他产物的大量合成。在这种情况下,不一定要高量表达,正常表达就可,往往可采用基因自身的启动子。

2转录的有效性:○为保证外源基因转录的有效性,在表达载体上应设法除去衰减序列或插入抗转录终止序列以避免转录的提前终止,保证mRNA 有效地延伸和终止。也可在终止密码子后增加终止子序列,使转录正确、有效终止。

3翻译起始的有效性:○要使翻译起始效率最高,要满足以下条件:选用最佳起始密码子AUG ;与SD 序列接近或与下列完全相同:5' …AGGAGG …3' ;除SD 序列外处于起始密码前的两个核苷酸应该是A 和U ;在不改变蛋白质功能的前提下,如果在起始密码AUG 后的序列是GCAU 或AAAA 序列,能使翻译效率提高;在翻译起始区不能形成明显二级结构。

4翻译的有效终止:在基因工程中,一般采用UAA 或一连串的终止密码来有效终止原核○

细胞的翻译。

导入受体细胞:

方法:

转化:通过生物学或理化方法使质粒DNA 或以质粒DNA 为载体构建的重组DNA 导入受体细胞内,并在受体内稳定维持和表达的过程,主要用于原核生物。

转化方法多种多样,我简单介绍一下细菌转化法。有的微生物细胞在不加任何处理的情况下就能直接摄取外源 DNA,只要外源 DNA与这样的细胞混合,在适宜的条件下悬浮培养,就能完成外源 DNA 的转化。大肠杆菌是目前基因工程中最常用的受体细胞。 通常采用的是大肠杆菌的感受态细胞,即在冰浴中用一定浓度的CaCl2处理对数生长期的大肠杆菌,以获得高效转化的感受态细胞。也有采用Rb+、Mn2+、K+、二甲亚矾、二硫苏糖醇(DTT)或用氯化己胺钴处理制备感受态细胞。感受态:是指受体细胞能吸收外源DNA 分子而有效地作为转化受体的某些生理状态。一般受体细胞在对数生长期转化能力最强。

筛选方案:

目的基因的表达方式:

1、外源基因以融合蛋白形式表达

融合表达是指目的基因与编码具有特殊活性的多肽或蛋白质的基因融合,

构建成一个融

合蛋白基因。此方法既可以保护外源蛋白不受宿主内蛋白酶的降解,同时也大简化了重组蛋白的纯化过程。

2、构建可分泌蛋白,到胞外培养基中

通过位于蛋白质N 端称为信号肽的一段氨基酸序列会帮助蛋白通过细胞膜。通过基因操作可在外源蛋白的N 端添加编码信号肽的DNA 序列,形成一个分泌蛋白。然而,此法不适合大肠杆菌,因为仅仅是信号肽序列的存在并不能确保高效分泌,并且大肠杆菌由于外膜的存在,也不能使分泌蛋白进入周围的培养基。

3、外源蛋白在宿主细胞中以包涵体形式表达

包涵体是致密的不溶性复合物,含有大部分的表达蛋白,可以抵抗宿主细胞中蛋白水解酶的降解,也便于纯化。一些以可溶性蛋白形式表达时易被降解的蛋白质,以包涵体形式表达时却可以很稳定。

外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位

1. 细胞质中表达

2. 周质中表达

3. 胞外表达

发展状况

随着基础生物科学和分子遗传学研究的突飞猛进,特别是随着人类对包括细菌在内的各种生物的基因组研究的深入,为提示种类生物基因结构与功能提供了大规模、高通量和自动化的研究手段和全新思路,细菌基因工程研究的范围也进一步拓宽。

在微生物基因工程农药方面,目前微生物农药主要有微生物杀虫剂、微生物杀菌剂、微生物除草剂及利用微生物代谢分泌的有效活性物质制成的农用抗生素杀虫、杀菌剂等。

在微生物肥料方面,利用微生物的生命活动及代谢产物的作用,改善作物养分供应,为农作物提供营养元素、生长物质、增强抗逆性,达到高产量、改善品质、减少化肥使用、提高土壤肥力的一类生物制品就是微生物肥料。

以及在食品和工业工程菌方面,都有很大发展。在医用抗生素上更是有很多突破,挽救了无数生命。

(完)


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