乳酸链球菌素的研究进展

乳酸链球菌素的研究进展

摘要:本文介绍了乳酸链球菌素(Nisin)的分子结构、性质、抗菌机理和生产的研究进展;综述了乳酸链球菌素在食品工业中的应用现状,并对其应用前景进行展望,以期为乳酸链球菌素的进一步研究提供参考.

关键词:乳酸链球菌素,抗菌机理,食品工业,应用

Abstract:Nisin is an antibacterial multipeptide produced by certain strain of Lactococcus lactis.It is a high efficiency and nopoisonous effect natural biopreservative.This paper comprehensive described research exploitation and progress about produce and applies of nisin. Key words:nisin;preservative;research and progress

乳酸链球菌素(Nisin)是世界上公认安全的防腐剂,是一种由微生物代谢所产生的具有很强杀菌作用的天然代谢产物。乳酸链球菌素本身具有许多优良性质:首先,容易被人体消化道中的一些蛋白酶和胰蛋白酶所降解,不会在体内蓄积而引起不良反应,并且对食品的色、香、味等无不良影响。使用它还可以降低杀菌温度,减少热处理时间,因此能改进食品的营养价值、风味、结构、颜色等性状,同时还可节省能耗。Nisin本身具有热稳定性,并耐酸、耐低温贮藏,Nisin作为一种理想的天然防腐剂获得越来越广泛的应用

1、乳酸链球菌素的研究现状

1.1乳酸链球菌素的分子结构

Nisin)亦称乳酸链球菌肽或音译为尼辛,是目前最常用的生物防腐剂,它是乳酸链球菌产生的一种多肽物质,由34个氨基酸残基组成。分子式为C143H228N42037S7,分子量为3510。Nisin分子结构中包含5种稀有氨基酸,分别为氨基丁酸 (ABA)、脱氢丙氢酸(DHA),R一甲基脱氢丙氨酸(DHB)、羊毛硫氨酸(ALA-S-ALA)和已一甲基羊毛硫氨酸(ALA-S-ABA),它们通过硫醚键形成五个内环,其活性体为二聚体或四聚体。到目前为止,已发现Nisin 分子的类型有A,B,C,D,E和Z,其中以Nisin A和Z两种类型的研究较多。NisinA与NisinZ的差异仅在于第27位氨基酸的种类不同。前者为组氨酸(His),后者为天冬酸胺(Asn),其抗菌特性几乎无差别 。

1.2乳酸链球菌素的性质

1.2.1 物理和化学性质

Nisin的溶解性、稳定性都与溶液的pH值密切相关。Nisin的溶解度随pH值的下降而提高,pH值2.5时溶解度为12%,pH值为5.0时下降至1J4%,在中性及碱性条件下几乎不溶解。实验结果表明,Nisin在酸性条件下极为稳定,pH2.0条件下可耐受高温处理(121℃,15min),而无活力损失,而在中性或碱性条件下即发生失活。

1.2.2生物学特性

当d一胰蛋白酶、胰酶制剂和枯草杆菌肽作用Nisin后,会使其失去活性,但羧肽酶A、羧肽酶E、肠肽酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶对Nisin无作用。Hurst报道。Nisin对凝乳蛋白酶、胰酶消化酶、唾液酶等很敏感,但对粗制凝乳酶、脂酶、淀粉酶不敏感,在酸性条件下,100℃、10min链酶蛋白酶不敏感。

1.3乳酸链球菌素的抑菌谱

Nisin抑制大部分革兰阳性菌及其芽孢的生长和繁殖.如葡萄球菌属、链球菌属以及梭状芽孢杆菌属和芽孢杆菌属的细菌,特别是对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌作用明显,在一定条件下,如冷冻、加热、降低pH值、EDTA处理等,乳酸链球菌素亦可抑制一些革兰阴性菌,如沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌等的生长

1.4乳酸链球菌素的抑菌机理

Nisin的抑菌机理是近年来的研究热点之一,并不断取得突破。其抑菌作用主要是杀菌,而非抑菌或溶菌。Nisin对营养细胞的作用主要是在细胞膜上,它可以抑制细菌细胞壁中肽聚糖等的生物合成,使细胞膜和磷脂化合物的合成受阻,导致细胞内物质外泄,引起细胞裂解。

1.5 Nisin合成的遗传学研究

编码Nisin的遗传密码的确切位置有两种理论,一种认为它与质粒连锁,另一种则认为是在染色体上。支持前一种观点的主要证据有:1947年,Kozak研究产Nisin菌株的突变现象时发现,若先以原黄素或溴乙啶诱变并进行高温处理,再以NTG进行诱变,未检测到回复突变株。并据此推测Nisin基因可能位于质粒上。进一步研究发现,Nisin的产生与一17.5MDa的质粒有关。,1991年,Kaletta和Entian从乳酸链球菌素6F3的质粒中成功克隆到了编码Nisin的结构基因。

但是.另外一些研究者认为Nisin基冈位于染色体上,并有实验证明一些产Nisin的菌株并不存在质粒ⅢI。对Nisin基因定位的研究最近取得的一些突破性进展,一些研究者根据对染色体的缺失与杂交实验提出Nisin结构基凶与染色体上的一个可接合转移的转座子有关。Horn等人则提出Nisin基因存在于70kb大小的转座子Tn5301巾,同时另一些研究者的工作也证实了这个转座子的存在,且发现Nisin基座是不稳定的。这些发现可能提示我Nisin基因位于一个可转座于质粒和染色体上的转座子巾,在不同的菌株中.Nisin基因的位置不一定相同㈣。

1988年,Nisin基因首次被克隆出来。不同于大部分的多肽类抗生素.Nisin前体蛋白是由核糖体合成,经过一系列包括脱水、硫环形成等复杂的翻译后加工过程,最终形成有活性的成熟Nisin分子110I。对Nisin遗传学研究的深入,将使我们有可能定向改变Nisin的溶解度、稳定性、抑菌范围等,对于Nisin的应用前景有着重大而深远的意义。

2 Nisin生产研究进展

2.1 Nisin产生茵的筛选

目前主要是利用Nisin产生菌rtInip+nisrsue+紧密连锁的原理.在添加乳链菌肽、蔗糖及溴甲酚紫的选择培养基上,从牛奶样品中定向筛选Nisin产生菌I”I。也有通过检测在BCP—CaCO,培养基中溶钙圈大小而间接选择Nisin生产菌方法的报道。

2.2 Nisin的发酵生产

在Nisin的生产中,主要是以乳链球菌和乳酸乳球菌作为生产菌,通过诱变方法获得高产菌株,并通过改变培养基配方以进一一步提高产量。其中,对培养基配方的研究进行的较为活跃。一方面,可以扩大Nisin应用.另一方而,对营养与产量关系的研究有助于了解Nisin生物合成的途径和调控方式

2.3发酵产物的提取工艺

2.3.1有机溶剂法

利用正丙醇作为主要的溶剂,因此也称正丙醇法。它利用正丙醇、丙酮、乙酸等有机溶剂沉淀Nisin,利用Kh2P0。等进行盐析,反复沉淀、溶解的过程.是一种经典方法,但其缺点是回收率低,回收产物活性低。

1960年Hawlev等用一种简单的方法提取Nisin。该法是先向发酵液中加入

0.1%Tween一80,然后从发酵液底部鼓气使产生大量的气泡,Nisin本身具有表面活性剂的性质,因而伴随泡沫被鼓斗收集并破碎泡沫后,用丙酮沉淀,最后将沉淀十燥测活,比活仅为1.4x1061U/g。、与正丙醇法相比鼓气吹泡法较容易形成规模化生产,操作简单,试剂消耗量少,但产品纯度低,回收率也不理想。

2.3.2吸附法

随着对乳链菌肽分子性质的研究,科研工作者发现产Nisin的乳酸菌对Nisin具有一定的吸附作用。1971年Bailey等利用Nisin与菌体吸附特性先收菌体,然后再获取Nisin提取液,再将其经过柱层析纯化Nisin。1992年Yang等对菌体吸附法的吸附及解吸附条件作了进一步研究发现如果对吸附及解吸附选择合适的pH,无需破碎菌体就可大量提取回收Nisin。其结果是最佳吸附pH为6.5,而解吸附。最佳pH为2.5。1 996年Jason等通过对Nisin与菌体吸附的深入研究。大胆地提出了一种设想。就是利用菌体对Nisin在高pH吸附、低pH解吸附的特性,构建一种固定化细胞柱,将含Nisin的粗品通过固定化细胞,Nisin就被吸附从而达到分离浓缩的目的。

另一种吸附法是应用一些吸附剂在合适条件下使其与Nisin吸附以达到提取纯化的目的。吸附剂包括硅酸、二氧化钛硅化合物(硅酸钙、二氧化硅、硅藻土等)。

2.3.3柱层析法

现在应用于分离纯化Nisin的介质较多,并且均可达到纯化的目的,但是南于所选前处理的方法不同,使得需要过柱的数目也不同,1995年我国山东大学刘稳等应用中空纤维超滤、非极性大孔网状吸附树脂xAD一2层析、CM—Sephadex C一25层析和Sephadex C一50分子筛层析等步骤纯化Nisin.分析其纯度不低于95%,比活为2.6x107IU/g,总同收率为20.6%。1995年Rod—riguez等采用Sepharose介质纯化Nisin,该法的预处理是用硫酸铵浓缩Nisin,然后依次通过Sp—Sepharose柱层析、Octyl—Sepharosecl一4B柱层析及PepRpc HR5/5 C2/C 1 8反向柱层析等步骤纯化NisinII,I。1 996年陈秀珠等应用正丙醇提取法将Nisin浓缩后再用CM—Sephadex C一25层析一步纯化了Nisin,其比活为

3.99x107IU/g,回收率41.7%。

1997年Suarez等又将一种传统的层析方法一免疫亲和层析应用分离纯化

Nisin并且获得了成功I埽J。该法是用ADl0杂交瘤细胞制备Nisin的单克隆抗体,并将其通过N一羟基琥珀酸亚胺葡聚糖柱,在一定条件下抗体与葡聚糖偶联,然后将Nisin发酵液除菌后进行柱层析。最终活性回收率可达72.7%,应用ReRpcHR5/5 C2/C18反向柱层析鉴定其纯度与Nisin标准品接近。这种利用抗体一抗原特异吸附性所设计的免疫亲和层析法纯化Nisin不仅操作过程简单,而且速度快,特异性好,重复性强。但其缺点是Nisin的单克隆抗体较难获得。

2.4发酵产物的效价检测

Nisin可以抑制G+菌的生长,可用微球菌作检测菌,测量其抑菌圈直径。Nisin在中性溶液中的溶解度远小于其在酸性溶液巾的溶解度,这样使得它在琼脂平板中扩散受影响。虽有一些方法,如用还原酶活性抑制剂、测定牛奶中酸产物的量、或测定OD值(比浊法)等可以作为衡量Nisin量的标准。但扩散仍是一个十分重要的技术,特别是当琼脂中加入了1%的Tween一20后,有利于扩散,且Tween一20的效果比Tween一80好。在0.5~10IU/mL的范围内,浓度的对数和抑菌圈直径呈直线关系。依之可作出标准曲线,再将待测样品与之比较,即可求出效价。测定食品中的效价要去除对照的影响。近年来,检测培养基又有一些改进,女[1JJHANa2HPO。可消除降低pH造成的假抑菌圈现象,提高检测灵敏度。另外,还有一些如反相平板、NOD:m吸收等一些用于相关目的的方法的报道。

总之,检测系统的发展趋势是简化检测方法和提高检测灵敏度。

3、乳酸链球菌素的应用

3.1 在酒精饮料中的应用

腐败乳酸菌对 Nisin 敏感 ,但酵母几乎不受其影响 ,因此 Nisin 可与酵母一起在生产啤酒、果酒、烈性乙醇等酒精饮料时加入 ,用于抑制革兰氏阳性菌。 啤酒在生产中易受乳酸杆菌和啤酒片球菌的侵袭,发生浑浊、酸变、发黏等现象。 Ogden 等以不加Nisin 的啤酒为对照,探讨 Nisin 的保鲜作用,结果表明, 加入 10 IU/mL Nisin 的啤酒存放期延长了 1 倍。在啤酒工业中,Nisin 能使啤酒花对嗜热性细菌的杀菌作用增强,在发酵过程中,剩余的 Nisin 仍能抑制细菌繁殖, 而对啤酒酵母的发酵特性无任何不良影响。

Radler 曾把 Nisin 应用于白酒制造中,试验表明,Nisin 能有效阻止长膜状明串球菌、 啤酒片球菌和乳酸杆菌的生长,防止了杂菌侵袭。 刘月琴等从试

验中得出结论:Nisin 可有效抑制啤酒制造过程中革兰氏阳性腐败菌的生长。 对厌氧菌污染比较严重的啤酒厂,添加 Nisin 可保证啤酒质量和风味的一致性。

3.2在肉制品中的应用

传统的肉质品(火腿、香肠等)中普遍使用亚硝酸钠、硝酸钠等发色剂来产生典型的腌制红色和腌制风味 ,并抑制肉毒梭状芽孢杆菌的生长 ,但这些添加剂同时对人体具有潜在的致癌危险,既产生了一种强烈的致癌物质——亚硝胺化合物。1980年,美国政府禁止在加工肉食品中使用硝酸盐, 这无疑是对肉品加工业的致命打击,很多的学者也试图尝试开发新的物质来替代硝酸盐。Rayman 等1981 年提出Nisin可作为一种有效的替代物 ,减少火腿中发色剂的用量。实验表明火腿中硝酸盐含量由原来的 0.015 %降到 0.004 %,产品品质仍保持良好 。袁秋萍认为从生产成本和防腐效果考虑 Nisin 在香肠中的适宜添加量为0.3g/ kg 。但是用大量的 Nisin 代替亚硝酸盐的防腐作用是不经济的 ,另外由于在肉制品中 Nisin 溶解度低 ,不易分布均匀等原因 ,防腐效果相对不如亚硝酸盐。

3.3在乳制品中的应用

Nisin 已成功应用于硬质干酪、巴氏灭菌干酪、巴氏灭菌奶、罐装浓缩牛奶、高温灭菌牛奶、高温处理风味奶、乳制甜点等制品中。 在干酪加工过程中,Nisin是最有效的保护剂。 乳酪中的微生物为丁酸梭菌、酪丁酸梭菌和生孢梭菌。 干酪原料经 80~100 ℃巴氏消毒后,梭菌芽孢仍能存活。 Taylor S 等研究表明,在经巴氏处理的干酪中加入 500~1 000 IU/mL Nisin 后,能阻止梭菌生长和毒素形成,同时还能降低食盐和磷酸盐用量。

Vanini 和 Moro(1967)的实践证明,在巴氏菌奶中添加低浓度的 Nisin 可减少细菌数。 Argentinian 认为质量分数 30~50 mg/L 的 Nisin 可以使巴氏消毒奶的货架期延长 2 倍。 郭清泉等通过试验证明, 添加40 IU / mL Nisin 至酸奶中, 可使酸奶的后酸化延长3d,且菌数保持在 107 以上,感官质量优异。

3.4在焙烤食品中的应用

焙烤食品大多数以高湿面粉为原料,经发酵、焙烤、冷却、包装而成。如面包、蛋糕、烤饼等。焙烤食品腐败的原因,多数是因产气菌和霉菌的繁殖而引起的。采用真空或气调包装,降低贮存温度,添加山梨酸盐等方法,可以延长制品

的保质期。但是,有耐热细菌如蜡状芽孢杆菌等引起的腐败常被忽视。事实上,这种污染菌在焙烤食品中生长而引起食物中毒的事故屡见不鲜。若在焙烤食品加工过程中添加乳酸链球菌素(Nisin),可以防止这类事故的发生。

4、前景展望

Nisin作为一种高效、无毒的天然食品防腐剂符合未来食品防腐剂的发展要求。它可广泛地应用于食品,特别是需经热处理的食品中,不但有较好的防腐抑菌作用,而且能减弱热处理强度,从而降低加工成本,改善风味、外观。Nisin 用于食品防腐时,会受到一些因素的影响,导致其抑菌能力下降。例如在未经热加工或经简单热加工的食品中,来源于微生物、植物或动物有机体的蛋白酶在食品货架期内可使Nisin 降解。使Nisin 发挥最佳作用的是液体和均一性的食品,对固体和异质性食品作用较差。在固体和异质性食品中需要适当增加Nisin的使用量。若将Nisin 配制成复配型防腐剂,可发挥广谱抑菌作用。孙京新等将Nisin 和乳酸钠联合加于西式火腿中,结果表明,二者联合使用,保质期比单独使用Nisin 长,并且降低了亚硝酸盐的含量。刘喜荣等通过对Nisin在延长豆奶保质期方面的研究表明,Nisin与某些盐类复合使用要比Nisin单独使用效果好。由单一型向复配型防腐剂转变,Nisin 的应用前景将更为广阔。

5、总结

天然食品防腐剂取代化学合成防腐剂是一种必然的趋势,乳酸链球菌素的开发和利用将对促进我国绿色食品的发展和保障人民身体健康具有重要的意义。随着食品行业的加大,乳酸链球菌素的 发展前景将更为广阔。

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