体外乙酰化

体外乙酰化/去乙酰化实验方法

1. GST蛋白表达纯化

接菌:

3mL LB + 3ul 抗生素 + 一个菌落(经BL-21转化后的)37℃ 225rpm摇菌过夜。

IPTG:

100 mL LB + 100ul 抗生素 + 1ml 菌液,37℃ 225rpm 4h;

4h后,每瓶(100ml)菌液 + 40ul IPTG,30℃ 225rpm 2h;

100ml菌液分装2个50ml离心管,离心4℃,5000rpm,10min,弃上清,置于-20℃保存备用。

GST:

1. 将-20℃保存的细胞(一管50ml离心管,另一管保留)置于冰上,加入3ml

冰预冷的PBS,重悬细胞,再加入150ul Triton-100(20%);

2. 将重悬好的细胞转移到15ml离心管中;

3. 将超声波细胞破碎仪预热10min;

4. 向15ml离心管中加入5ul PIC, 5ul PMSF, 5ul Na3VO4;

5. 破碎细胞:次数:6-8次,间隔:60-120s,每次:10-15s

(实际使用:次数:6;间隔:60’’,每次:10’’);

6. beads预处理:用前混匀,133ul beads,离心4℃,2500rpm,5min,弃上清

(吸取33ul上清,弃之),得100ul beads (2个样品) ;

7. 用1ml PBS洗1次beads,混匀,离心4℃,2500rpm,5min,弃上清,+ 150ul

PBS重悬,分装4管,每管62.5ul;

8. 将破碎后的3ml样品分装到2个Ep管中,离心4℃,13000rpm,15min,将

上清转移至分装好的beads管中,4℃摇床摇匀过夜or RT 摇床摇匀1h;

9. 离心4℃,2500rpm,5min,弃上清;

10. 加入预冷PBS 1ml,混匀,离心4℃,2500rpm,5min,弃上清;

11. 重复步骤10两遍,即用PBS洗3次;

12. 每1个Ep管中加入100ul PBS(即:每3ml原样品对应2支Ep管),4℃保

存。

制备PAGE胶样品:

GST后的样品,取30ul置于已经标记的Ep管中,加入30ul loading Buffer,将该Ep管管盖上扎孔,煮沸5min,置于冰上备用,或-20℃保存。

PAGE 电泳,200V, 40min左右;

电泳后,用考马斯亮蓝染色,过夜,观察并记录结果,如若需要,拍照保存。

2. 体外乙酰化反应

在1.5mlEP管中配置乙酰化反应体系,

总体积50ul:

GST-底物:5ug

GST-乙酰化酶: 1ug

Ac-coA: 20uM

Tris-HCl(pH8.0):50uM

EDTA: 0.1mM

DTT: 1mM

甘油: 10%

混匀,30℃,反应1个小时。

反应后,Western blot 用抗乙酰化赖氨酸的抗体(CST)检测乙酰化效果。 3. 体外去乙酰化反应

乙酰化反应的产物,用去乙酰化反应缓冲液洗涤一次,配置去乙酰化反应体系,总体积50ul:

GST-Ac-底物:5ug

GST-去乙酰化酶: 1ug

NAD+: 60uM

Tris-HCl(pH8.0): 25uM

NaCl: 137mM

KCl: 2.7mM

MgCl2: 1mM

30℃,反应1个小时。

反应后,Western blot 用抗乙酰化赖氨酸的抗体(CST)检测乙酰化效果。


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