胶体金的制备方法

一、制备胶体金的准备

(一)玻璃器皿的清洁

制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成,形成的颗粒大小不一,颜色微红、无色或混浊不透明。我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲洗干净,加入清洁液(重铬酸钾1000g,加入浓硫酸2500ml,加蒸馏水至10000ml)浸泡24h,自来水洗净清洁液,然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗3~4次,自来水冲洗掉洗洁剂,用蒸馏水洗3~4次,再用双蒸水把每个器皿洗3~4次,烤箱干燥后备用。通过此方法的处理玻璃器皿不需要硅化处理,而直接制备胶体金。也可用已经制备的胶体金溶液,用同等大不颗粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面,然后弃去,再用双蒸水洗净,即可使用,这样效果更好,因为减少了金颗粒的吸附作用。

(二)试剂的配制要求

按照Frens法还可以制备出其它不同颗粒大小的胶体金出来。许多研究证明用该法制备胶体金时金颗粒的大小是柠檬酸三钠用量的函数,基本的规律是柠檬酸三钠用量多,胶体金颗粒直径小,柠檬酸三钠用量越少,腔体金颗粒直径越大。

(1)所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净,配制试剂用双蒸馏水或三蒸馏水。

(2)氯化金(HauCl4水溶液的配制:将lg的氯化金一次溶解于双蒸水中配成1%的水溶液。放在4”c冰箱内保存长达几个月至1年左右,仍保持稳定。

(3)白磷或黄磷乙醚溶液的配制:白磷在空气中易燃烧,要格外小心操作。把白磷在双蒸水中切成小块,放在滤纸上吸于水份后,迅速放入已准备好的乙醚中去,轻轻摇动,等完全溶解后即得饱和溶液。储藏于棕色密闭瓶内,放在阴凉处保存。

柠檬酸三钠还原法(Frens 1973)此方法是由Frens在1973年创立的,制备程序很简单,胶体金的颗粒大小较一致,广为采用。该法一般先将0.01%的HAuCl4溶液加热至沸腾,迅速加入一定量1%柠檬酸三钠水溶液,开始有些蓝色,然后浅蓝、蓝色,再加热出现红色,煮沸7~10min出现透明的橙红色。各种颗粒的胶体金制备详见表5-2。表5-2 柠檬酸三钠用量与胶体金颗粒直径的关系

溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子。目前常用的还原剂有:白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等,下面分别介绍制备不同大小颗粒的胶体金溶液。

二、制备胶体金的方法和步骤

窄长型膜,依灵敏度及流速的要求,选用孔径不同的合适的膜.自下端至上端(由左至右)由:

1. 样品垫(sample pad)

2. 载有固相标记配体(抗体或抗原)的玻璃纤维素膜条或聚酯膜条(conjugate release

membrane)

3. 合适孔径的硝酸纤维素膜条(喷涂有显示阳性结果的捕捉分析物的配体线,和阴性对照

组线)(ni-trocellulose memtrane)

4. 吸水垫(absorbent pad)等四部分衔接固定在不干扰免疫反应和流速的簿塑料背板上

(back sheet)

胶体金快速斑点结合免疫分析

随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业(diagnostic industry),免疫分析向两个方向发展:一类为全自动化的免疫分析;另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒,目前只能在医疗及检测中心应用,虽也能较快速给出结果,但仍需一定时间,不适合远离医疗及检测中心的地区,更不能用于“患者床旁检验”(real time clinical decision)和普查的需要,在酶免疫分析的基础上,主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析(dot immunobinding assay, DIBA),始于80年代。现介绍如下:

1 两种模式

1.1 班点免疫渗滤分析(dot immunofiltrtion assay, DIFA) 免疫反应是通过垂直穿透固定有配体的硝酸纤维素膜而进行的(flow through type)。

1.2 斑点免疫层析分析(dot immunochro-matography assay ,DICA) 分析原理与DIFA相同,只是反应液体的流动不是直向的穿透流动,而是层析作用的横向流动(lateral flow type),在1990年开始应用。

两种类型快速免疫分析比较见表。

表 免疫渗滤分析和免疫层析分析的比较

注: 以上标记配体均为胶体金或硒标记、分散型染料标记等。如为酶标记则二者都必须增加“加显色底物”的步骤

2 标记物的种类

标记物包括、胶体金属(胶体金,胶体硒)、分散型染料(disperse dyes)和染料标记的微球(latex particles)等,标记物各有优缺点,可根据以下的标准选择,如:灵敏度,所需要的颜色,分析的模式和操作步骤,制备、保证重复性、急定性及规模及的难易程度和重复性,以及标记物所需配体量等。其中酶虽然有高灵敏度,重复性好及标记物易规模化等优点,但它需要洗涤,加底物等步骤,需要反应的时间也长些,对技术也有一些要求,故未能作为快速诊断的主要标记物(1985年最初的免疫渗滤分析是以酶作为标记物)。目前应用最广泛的标记物为胶体金,包括:胶体金免疫渗滤分析(gold immumofiltraition assay GIFA)或滴金免疫分析和胶体金免疫层析分析(gold immunochromatography assay , GICA)。由于GICA更简便快速,已成为目前最主要的快速免疫分析方法之一。

3 原理

胶体金免疫渗滤分析(GIFA)原理与操作步骤基本与ELISA相同:加样品于固定有配体(抗体或抗原,此处以抗体为例,下同)的硝酸纤维素膜上,通过渗滤在膜中形成抗体-抗原复合物,洗涤渗滤后,再加液体的胶体金标记抗体。当结果为阳性时,在膜上固定有抗体-抗原-胶体金标记抗体复合物而呈现红色斑点。胶体金免疫层析分析CICA原理与GIFA相同,只是操作步骤有所不同,如反应液体流动方向由垂直渗滤改为横向层析流动(见表):样品加样品垫(1)上,样品向吸水垫(4)方向流动,途径载有固相胶体金标记抗体膜(2)后,将金标记物完全复溶,抗原与金标记抗体形成金标记抗体-抗原复合物,继续向前流动至硝酸纤维素膜条(3)上,固定有捕捉抗原的抗体线处。当结果为阳性时,金标记抗体-抗原复合物上,就会形成金标记抗体-抗原-固相抗体复合物,呈现红色阳性条带;如样品中无抗原,则不被捕获,就不显色,则结果为阴性。多余的游离金标记抗体继续前移至固定有抗金标记体二抗处,被固定呈现红色的阴性对照。GICA与GIFA不同之处在于后者只是单一的免疫层析条,不需要其它试剂,一步操作。二者与ELISA不同处是反应时间大大缩短,仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。因为在GIFA和GICA中,高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中,待测抗原在渗滤或层析时,流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触,很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用(immunoconcentraiton)。在ELISA中,待测抗原要在液相中经过扩散作用,逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时,标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物,故需时间较长。

4 胶体金块快速免疫结合分析的应用

应用领域很广,可分为临床应用与非临床应用两类。目前应用多以前者为主。

4.1 临床应用 已应用于临床的很多领域。由于目前它还是定性分析,故主要用以检测正常体认中不存在的生物活性物质(如传染病的抗原及抗体),以及正常情况下体液中含量很低而在某些疾病中升高的生物活性物质。随着技术的进展,对某些可确定诊断的、有正常上限值(cutoff)的生物活性物质也可进行检测。下面列出国内外已应用的项目。

4.1.1 传染病 (1)各种病毒的相应抗原及抗体:各种病毒性肝炎、巨细胞病毒抗体,单纯疱疹病毒抗体,风疹病毒抗体,肾综合症出血热抗体,登革热病毒抗体及轮状病毒等;

(2)性病:爱滋病病毒抗体,梅青螺旋体抗体,淋球菌及泌尿生殖系统的衣原体等;(3)细菌:结核杆菌抗体,A族乙型溶血链球菌、沙门氏菌、幽门螺旋杆菌抗体等;(4)寄生虫:疟原虫,血吸虫抗体,包囊虫抗体,弓形虫抗体等。

4.1.2 激素 目前用于生殖标志物,主要有诊断早早孕的人绒毛膜促性腺激素(HCG)和检测排卵的促黄体生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)等。

4.1.3 心血管病 急性心肌梗死的标志物,包括肌酸激酶的同工酶CK-MB,肌红蛋白,肌钙蛋白-T及脂肪酸结合蛋白质(PABP)等。还有与心血管疾病有重要关系的D-二聚体(D-dimer)的检测。

4.1.4 肿瘤 包括对肿瘤进行筛查和早期诊断有意义的肿瘤标志物,如前列腺特异抗原(PSA),AFP,CEA,CA125及CA15-3,以及对肠道肿瘤筛查有重要意义的大便潜血免疫检测(FOB)等。

4.1.5 自家免疫病 抗双链DNA抗体和诊断甲状腺自家免疫病的甲状腺过氧化物酶(TPO)抗体。

4.1.6 毒品 检测尿液中的可卡因、大麻、吗啡、海洛因、苯丙胺等。国外报道有可同时测7种毒品的GICA。

4.1.7 其它 检测C-反应蛋白,半定量检测血清α-脂蛋白。

4.2 非临床应用 可用于食品检测,环境污染,生物沾染,还可用于生物战剂的快速检测,兽医学及法医学等方面检测。

5 制作及操作中需注意的问题

以GICA为例,它将几种组分优化组合成一个整体的免疫层析分析条,许多条件及条件的组合都会影响到它的质量,包括:

(1) 硝酸纤维素膜的性能和质量,膜孔径大小及均一性,选定膜孔径的适宜性,结合配

体(抗原或抗体)容量的大小,非特异吸附性能,亲水性及液体的流动性和流动速

度的均一性等;

(2) 捕捉配体的量及质量(配体的纯度,亲和力及滴度)及在膜上配体的包被量和均一

性。配体划线位置的固定一致性;

(3) 固相金标记膜中的胶体金和配体的含量和比度,条间的均一性,固相标记物的稳定

性,复溶性,复溶速度及流动性,所含缓冲物质的种类及有效促溶剂的使用等;

) 各种膜,甚至包括样品垫是否经过预期处理以减少非特异吸附。

以上条件都可以综合影响胶体免疫层析的质量控制,主要包括:灵敏度,阴阳性界限值(cutoff)的准确性和一致性及层析条间的重复性等。

) (1)灵敏度:因测定主要针对正常人体液中不存在或含量很低的生物活性物质的定性结果。

高灵敏度及其重复性是最重要的质量控制指标。为此,生产厂家在保证分析条的各种优化条件外,还应提供能确证灵敏度的标准品,供操作者检验其灵敏度和重复性。另外,还应配有相应的阳性及阴性对照血清以供对照之用。

(2)阴阳性界限值的准确性和重复性:避免发生假阴性人假阳性结果,保证结果的正确。生产厂家应提供确定界限值的标准品,最好还要提供低于或高于界限值的标准品(注明浓

度),以供使用者对结果的判断。

6 应用的重点和展望

临床应用的重点应放在:(1)急需快速诊断以便进行治疗的急重症,如协助确诊急性心肌梗死的急性心梗标志物就是很好的例子。有普查意义的检查和流行病学调查:如各种传染病(病毒性肝炎,艾滋病,性病及其它各种流行病)流行病调查;某些肿瘤(如前列腺癌,结肠癌,肝癌,乳腺癌)的普查及预防检查;围产期的健康普查等。它可以作为快速的初筛普

查手段,对阳性和可疑的结果再进一步做更细的可靠的检查。

今后的发展:(1)全面提高质量。突出质量控制的保证,为进一步发展打好基础。

(2)提高检测的灵敏度。目前检测的灵敏度都低于相应的定量免疫分析,应尽量缩小差距。除使用各种优质的原料,如膜条,高纯度高亲和力的配体(特别是配伍好的优质单抗),优质高比度的标记配体以及先进的工艺外,还应引进信号放大系统,例如生物素-链亲和素系统,用链亲和素作为膜上的捕捉配体,分别用生物素化和胶体金标记的配伍良好的优质的特异性单抗与分析物形成免疫复合物。应用链亲和素与生物素结合的四价性及极高的亲和常数,可明显提高灵敏度。此外,链亲和素-生物素系统还可以作为一种通用的分析系统,检测不同的抗原。由于链亲和素价格较贵,也可用高质量的抗生物素抗体作为通用的检测系统。

(3)实现半定量和定量化。①可通过精确控制膜上捕捉配体的量,使用多条平行捕捉配体线的方法,通过显色条带的数目,判断分析物的浓度区间,得到半定量的结果;②应用反射的光密度计测量显色带或斑点的颜色强度,换算成浓度值,实现定量的估算。德国宝灵曼生产的肌钙蛋白-T及相应的测量仪(strip reader)即可显示出免疫层析条上肌触目惊心蛋白-T的量。香港研制的FABP胶体金免疫渗滤分析也配有定量分析仪,可进行定量测定。二者均成为患者床旁诊断急性心肌梗死的快速灵敏方法。

(4)检测多种分析物。同一个膜上可同时测定几种有相关意义的分析物,如乙型肝炎不同的抗原及抗体。国外已有同时测几种心梗标志物及测定多种毒品的胶体金免疫分析。

(5)建立检测全血的方法。主要针对急重症快速诊断之用,以减少分离血清的音间。德国宝灵曼生产的人肌钙蛋白GICA便采用全血检测方法。检测全血的方法对自检,患者床旁检查和边远地区的普查都有实际应用意义。

免疫胶体金的制备及其在医学检验中的应用

周友泉

[斑竹]胶体金是一种常用的标记技术,有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电

镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。

1971年Faulk 和Taytor将胶体金引人免疫化学,此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法,在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法( immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA),用于检测 HBsAg、HCG 和抗双链DNA抗体等,具有简单、快速、准确和无污染等优点。

免疫胶体金技术的基本原理

氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金。胶体金标记,实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷,与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能,可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合,因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。

免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性,在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中,这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大,称之为免疫金银染色。

胶体金的制备方法

胶体金的制备一般采用还原法,常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。下面介绍最常用的制备方法及注意事项。

1、玻璃容器的清洁:玻璃表面少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成,一切玻璃容器应绝对清洁,用前经过酸洗、硅化。硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于5%二氯二甲硅烷的氯仿溶液中1分钟,室温干燥后蒸馏水冲洗,再干燥备用。专用的清洁器皿以第一次生成的胶体金稳定其表面,弃去后以双蒸馏水淋洗,可代替硅化处理。

2、试剂、水质和环境:氯金酸极易吸潮,对金属有强烈的腐蚀性,不能使用金属药匙,避免接触天平称盘。其1%水溶液在4℃可稳定数月不变。实验用水一般用双蒸馏水。实验室中的尘粒要尽量减少,否则实验的结果将缺乏重复性。 金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞,故不能用pH电极测定金溶液的pH值。为了使溶液pH值不发生改变,应选用缓冲容量足够大的缓冲系统,一般采用柠檬酸磷酸盐(pH3~5.8)、Tris-HCL (pH5.8~8.3)和硼酸氢氧化钠(pH8.5~10.3)等缓冲系统。但应注意不应使缓冲液浓度过高而使金溶胶自凝。

3、柠檬酸三钠还原法制备金溶胶:

取0.01%氯金酸水溶液100ml 加热至沸,搅动下准确加入1%柠檬酸三钠水溶液 0.7ml,金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色,继续煮沸15分

钟,冷却后以蒸馏水恢复到原体积,如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在535nm,A1cm/535=1.12。金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关,一旦颗粒大小发生变化,光散射也随之发生变异,产生肉眼可见的显著的颜色变化,这就是金溶胶用于免疫沉淀或称免疫凝集试验的基础。

金溶胶颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的,保持其他条件恒定,仅改变加入的柠檬酸三钠量,可制得不同颜色的金溶胶,也就是不同粒径的金溶胶,见附表。

附表 100 ml 氯金酸中柠檬酸三钠的加入量对金溶胶粒径的影响

1%柠檬酸三钠ml 0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00

金溶胶颜色 蓝灰 紫灰 紫红 红 橙红 橙

吸收峰(nm) 220 240 535 525 522 518

径粒(nm) 147 97.5 71.5 41 2 4.5 15

4、柠檬酸三钠-鞣酸混合还原剂:用此混合还原剂可以得到比较满意的金溶胶,操作方法如下:取 4ml1%柠檬酸三钠 (Na3C6H5O7.2H2O),加入0~5ml1%鞣酸,0~5ml 25mmo/L K2CO2(体积与鞣酸加入量相等),以双蒸馏水补至溶液最终体积为20ml,加热至60℃取1ml1%的 HAuCl4,加于79ml双蒸馏水中,水浴加热至60℃,然后迅速将上述柠檬酸-鞣酸溶液加入,于此温度下保持一定时间,待溶液颜色变成深红色(约需0.5~1小时)后,将溶液加热至沸腾,保持沸腾5分钟即可。改变鞣酸的加入量,制得的胶体颗粒大小不同。

5、白磷还原法:在120ml双蒸馏水中加入1.5ml1%氯金酸和1.4ml 0.1mol/L K2CO3,然后加入 1ml五分之一饱和度的白磷乙醚溶液,混匀后室温放置15分钟,在回流下煮沸 直至红褐色转变为红色。此法制得的胶体金直径约 6nm,并有很好的均匀度,但白磷和乙醚均易燃易爆,一般实验室不宜采用。 要得到大小更均匀的胶体金颗粒,可采用甘油或蔗糖密度梯度离心,经分级后制得胶体金颗粒直径的变异系数(CV)可小于15%。

免疫胶体金制备

1、蛋白质的处理:由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附,并可使溶胶聚沉,故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意,蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒,否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。

一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在,因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。

2、蛋白质最适用量的选择:将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后,分别取0.1ml(含蛋白质5~40ug)加到 1ml胶体金溶液中,另设一管不加蛋白质的对照管,5分钟后加入0.1ml 10%NaCl溶液,混匀后静置2小时,不稳定的金溶胶将发生聚沉,能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10%即为最佳标记蛋白量。 3、标记:在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的,在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。

下述标记步骤最为常见:

①用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH(标记SPA时调到pH6.0)。

②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液(体积为2~3ml),搅拌2~3分钟。

③加入5ml1%PEG20000溶液。

④于10000~100000g离心30~60分钟(根据粒径大小选择不同离心条件),小心吸去上清液(切忌倾倒)。

⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2~0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中,离心沉淀后,再用同一缓冲液恢复,浓度以 A1cm/540nm=1.5左右为宜,以 0.5mg/ml叠氮钠防腐,置4℃保存。

⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化,以含 0.1%BSA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2,以A蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0。

以上操作中应注意,一切溶液中不应含杂质微粒,可用高速离心或微孔滤膜预处理。

胶体金的稳定性及免疫胶体金的贮存

胶体金具有很高的动力学稳定性,在稳定因素不受破坏时自身凝聚极慢,可

放置数年不发生凝聚。影响稳定的因素主要有电解质、溶胶浓度、温度、非电解质等。

金溶胶必须有少量电解质作稳定剂,但浓度不宜过高。高浓度亲水性非电解质能剥去胶粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物质促使溶胶凝聚,但一定量的高分子物质反而可增加溶胶稳定性,如蛋白质、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的稳定效果。

当金溶胶吸附蛋白质后,溶胶的稳定性随溶液pH而变化,而这种变化又取决于吸附蛋白质的等电点,如ConA,过氧化物酶等,当pH较低时保持稳定,提高pH则显得不稳定,接近等电点或略高时又变得稳定了。标记后的胶体金溶液可用0.2~0.5mg/ml PEG20000 作为稳定剂。在4~10℃贮存数月有效,不宜冰冻。贮存中可能会发生程度不同的凝聚,可离心除去。

免疫胶体金的应用

1、胶体金在电镜水平的应用

胶体金应用电镜水平的研究最早,发展最快,应用最广泛。其最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。直径为3~15nm 胶体金均可用作电镜水平的标记物。3~15nm 的胶体金多用于单一抗原颗粒的检测,而直径15nm 多用于检测量较多的感染细胞。

胶体金用于电镜水平的研究,主要包括:①细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。②单层培养中细胞内抗原的检测。③组织抗原的检测。

金标记在电镜水平的应用,主要方法包括:包埋前染色、包埋后染色、免疫负染色、双标记技术和原位杂交技术等。

实验证明,该法样本用量少、检测速度快、对比明显、操作简单、敏感性和特异性高,既可用于抗原检测,也可用于抗体检测,因此,可同时适用于科研和诊断。

2、胶体金在光镜水平的应用

胶体金同样可用做光镜水平的标记物,取代传统的荧光素、酶等。各种细胞涂片、切片均可应用。主要用于:①用单克窿抗体或抗血清检测细胞悬液或培养的单层细胞的膜表面抗原。②检测培养的单层细胞胞内抗原,③组织中或亚薄切片中抗原的检测。

胶体金用于光镜水平的研究,可以弥补其它标记物不可避免的本底过高和内部酶活性干扰等缺点。

3、胶体金在流式细胞仪中的应用:

应用荧光素标记的抗体,通过流式细胞仪计数分析细胞表面抗原,是免疫学研究中的重要技术之一。但由于不同荧光素的光谱相互重叠,区分不同的标记困难,因此必须寻找一种非荧光素标记物,用于流式细胞计数。这样可以同时进行几种标记。该标记物必须能够改变散射角,胶体金可以明显地改变红激光散射角,因而可以作为流式细胞仪的标记物之一。

4、凝集试验:单分散的免疫金溶胶呈清澈透明的溶液,其颜色随溶胶颗粒

大小而变化,当与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚,溶胶颗粒极度增大,光散射随之发生变化,颗粒也会沉降,溶液的颜色变淡甚至变成无色,这一原理可定性或定量地应用于免疫反应。

5、免疫印迹技术(immunoblotting):免疫印迹是一种较新的免疫化学技术。用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离,得到的区带转移至硝酸纤维素膜,然后用酶免疫法(或免疫荧光、RIA)进行定量。

免疫胶体金也可用于该法的定量。转移后的硝酸纤维素膜与某特异性的抗体保温后,再与经葡萄球菌A蛋白致敏的胶体金温育,彻底洗去多余的胶体金,根据膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。

利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理,采用银显影剂增强金颗粒的可见性,更可大大提高测定灵敏度,检测下限可低至 0.1ng,这种免疫金银染色法应用已日趋广泛。

由于胶体金免疫印迹技术简便、快速,且有相当的高的灵敏度,在临床免疫诊断上有很大的应用潜力。

6、胶体金在肉眼水平的应用

胶体金取代传统三大标记物,用于肉眼水平的免疫检测中。除了胶体金本身具有的特点外,还有以下优点:①试剂和样本用量极小,样本量可低至1~2ul;②不需γ-计数器、荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器,更适于现场应用; ③没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与;④实验结果可以长期保存;

⑤时间大大缩短,提高了检测速度。金标过程中,无共价键形成,是一定离子浓度下的物理吸附。因此几乎所有的大分子物质都可被金标记,标记后大分子物质活性不发生改变。实验结果表明,胶体金的敏感性可达到 ELISA的水平。而结合银染色时,检测的敏感性更大大提高。

胶体金在免疫层析快速诊断技术中的应用

免疫层析法(immunochromatography)是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术,其原理是将特异的抗体先固定于硝 酸纤维素膜的某一区带,当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后,由于毛细管作用,样品将沿着该膜向前移动,当移动至固定有抗体的区域时,样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合,若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色,从而实现特异性的免疫诊断。

早孕诊断用的免疫层析试

纸条(通常又叫尿妊纸条)的装

配结构见图一。

装配方法:在塑料底板上分

别将吸尿用玻璃纤维、冻干金标

记抗α-HCG玻璃纤维、已固定有抗β-HCG抗体的NC膜及硬质吸水滤纸按图装配,配件与塑料底板的结合可用双面胶或其它粘性材料粘接。装配好的纸板按纵向剪切,裁成宽 度为4mm的条状,即为尿妊用纸条。

本法检测速度快,一般一两分钟可出结果;灵敏度高,可达50IU/L;好的试纸条结果也是准确可靠的,这是其所以能在尿妊诊断中得到广泛应用的主要原因。尿妊试纸条的快速特性来源于胶体金免疫层析法的固有特性,但与原材料选择特别是NC膜的孔径大小密切相关,准确性取决于抗β-HCG的特异性。 金标尿妊纸条虽然好用,但在使用中也必须注意以下几个方面:一是温度,试纸条虽然可在室温保存,但大批暂时不用的试纸条还是应该放在4℃保存,以免抗体失效,从冰 箱刚取出的试纸条则应待其恢复至室温,然后才打开密封,可避免反应线模糊不清。二是正确操作,一般的操作方法是在试纸条的吸尿玻璃端滴入2滴(约100微升)尿液,或将吸尿端直接插入标本中,深度约10~15毫米20秒,取出后平放,这种方法比较麻烦且容易造成污染。我们的方法是取尿标本约0.5ml 加入小试管中,然后插入试纸条,待1~2分钟反应带清晰后观察结果。

胶体金在快速斑点渗滤技术中的应用

ELISA法在临床实验室已得到普遍的应用,特别是用于各型肝炎标志物的检测。但ELISA法由于操作程序复杂,时间较长,给实验室带来不便。因此出现一步法快速检测试剂盒,虽可提高检测速度,但有出现假阴性结果的弊端。ELISA法需时较长的主要原因,是由于液相中的抗原(或抗体)需经扩散才

能与固相上的抗原或抗体反应不适当地缩短反应时间,将使灵敏度降至临床要求以下。为满足临床快速检测的需要,近年来发展了多种简便、快速的免疫学检测方法,快速斑点渗滤法即为其中一种,其标记物质用胶体金即称为快速斑点免疫金渗滤法Dot-immunogold filtration assay),又称滴金免疫法。

快速斑点渗滤法的基本原理仍是间接法或夹心法。间接法测抗体:固定于膜

上的特异性抗原+标本中的相

应抗体+金标记的抗抗体或S

PA显色。夹心法测抗原:固定

于膜上的多克隆抗体+标本中

待测抗原+金标记的特异性单

克隆抗体显色。

结果判断:快速斑点免疫金

渗滤法在操作完成后即可直接

观察结果。根据测定模式的不同

可有以下不同的判定结果。

快速斑点免疫金渗滤法检

测速度快,结果观察一目了然,

已应用于多种临床检测项目。

以上分析可以看出,胶体金

标记技术是继三大标记技术之后,又一较为成熟且已得到广泛应用的免疫标记技术。

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