1株副溶血性弧菌Bh_06的分离_鉴定及其药敏试验

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微生物学杂志 2010年1月第30卷第1期 JOURNALOFMICROBIOLOGYJan.2010Vo.l30No.1

1株副溶血性弧菌Bh-06的分离、鉴定及其药敏试验

黄玉柳

(广西水产研究所,广西南宁 530021)

摘 要 从患病的南美白对虾分离出1株副溶血性弧菌Bh-06,通过革兰染色和Biolog全自动细菌鉴定仪鉴定,并对健康南美白对虾进行攻毒试验和对该菌株进行药物敏感试验。试验结果表明:Bh-06菌株为革兰阴性弧菌,通过细菌自动鉴定仪鉴定为副溶血性弧菌;该菌在培养第5小时进入对数早期,对数期一直延续到25小时;该菌在[email protected]/mL浓度时可引起南美白对虾发病,而且浓度越高,病症越严重;该菌对氧哌嗪青霉素产生高度的敏感性。

关键词 副溶血性弧菌;分离;鉴定;药敏试验

中图分类号 Q93-331 文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2010)01-0068-03

Isolation,IdentificationandDrug-Sensitivitytest

ofaVibrioparahaemolyticusStrainBh-06

HUANGYu-liu

(TheFisheryInstituteofGuangxi,Nanning530021)

Abstract Vibrioparahaemolyticus(Vp)Bh-06wasisolatedfromthelivertissueofdiseasedSouthAmericanwhiteprawn(SAWP)(Penaeusvannamei).AfterGramstainingandBiologautomatedbacterialidentificationinstrumentidentification,andattackedhealthySAWPwithisolatedVpanddrug-sensitivetestedtotheisolatedstrains,There-sultsshowed:ThisstrainwasGram-negativevibrioanditwasidentifiedasVibrioparahaemolyticusbyautomaticiden-tificationofbacteria;Thegrowthcurveofthepathogenshowedthatithadlogarithmgrowth5hoursafterchallenge,andlastedfor25hours;[email protected]/mLofPenaeusvannameicouldcauseSAWPdisease,andhigherthecon-centration,themoreserioustheillness;ThebacteriashowedhighlysensitivetooxygenPiperacillin.Keywords Vibrioparahaemolyticus;isolation;identification;drug-sensitivetest

随着水产养殖业的发展,养殖方式已发生巨

大变化,由过去的粗放型逐渐过渡到工厂化、集约化高密度养殖,但在追求高密度、高产量同时,投喂量也随之增加,并不同程度造成水环境的污染,极易引起病原体的大量繁殖。弧菌是一种条件致病菌,当前,弧菌病已成为养殖对虾的主要细菌性病害之一。每年因此类疾病带来的经济损失数以亿计,各养殖场为预防和治疗这些疾病,也花费了大量的资金。副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyti-cus)是我国沿海地区食物中毒的主要病原菌,由该菌引起的食物中毒有起病急、发病率高的特点。

本研究从患病南美白对虾中分离出1株副溶血性

弧菌Bh-06,用Biolog全自动细菌鉴定仪进行鉴定,并对该菌株进行药物敏感试验,为生产上对该病原菌防治的药物选择提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 副溶血性弧菌Bh-06,由患病南美白对虾分离所得。1.1.2 培养基 TCBS平板(北京路桥技术有限责任公司),胰蛋白胨平板,2216E平板(海博生物

作者简介:黄玉柳 女,工程师,硕士。主要从事水产病害研究工作。E-mai:[email protected]:

1期 黄玉柳:1株副溶血性弧菌Bh-06的分离、鉴定及其药敏试验 69

技术有限公司)。

1.1.3 仪器和试剂 UV-2102C紫外可见分光光度计(尤尼柯仪器公司);Biolog全自动细菌鉴定仪(BIOLOGMicrolog产品);药敏试纸(北京天坛药物生物技术开发公司)。1.2 方法

1.2.1 副溶血性弧菌Bh-06的分离 取对虾肝胰腺组织和肠道,分别放入无菌的玻璃匀浆器,加入1mL无菌水,匀浆,然后取100LL匀浆液在准备好的TCBS琼脂平板上涂布均匀,放入30e培养箱培养18~24h。第2天在超净工作台上挑取单个蓝色或蓝绿色菌落。再用TCBS平板划线。分离3~4次即可获得纯化的菌株(命名Bh-06)。接种于固体蛋白胨培养基斜面上,培养24h,加入灭菌石蜡,于4e冰箱短期保存。1.2.2 副溶血性弧菌Bh-06的鉴定 副溶血性弧菌Bh-06的鉴定采用Biolog全自动细菌鉴定仪,根据革兰染色结果及简单生理生化性质,选定相应的Biolog鉴定板条,具体操作见文献[1]。1.2.3 副溶血性弧菌Bh-06生长曲线的测定 将副溶血性弧菌Bh-06接种于胰蛋白胨水中,30e,100r/min摇床培养。从接种开始,每2h取样1次,在波长为600nm下用紫外可见分光光度计测定培养液的OD值。测定OD值与培养时间的关系,判断副溶血性弧菌Bh-06的生长情况。1.2.4 南美白对虾攻毒试验 根据文献[2-3]的方法,本试验略为改动。取平均长约11cm的健康南美白对虾,放养于水族箱内,水约100L,海水盐度18%,虾60尾,室温。并将试验分为6组(1~5组和对照组),使水族箱中的养殖水的含菌量分别为[email protected][email protected][email protected][email protected][email protected]/mL,浸泡感染,每天观察各组虾的发病情况。1.2.5 副溶血性弧菌Bh-06的敏感性试验 采用试验试纸法,将纯化好的副溶血性弧菌Bh-06,用无菌海水制成菌悬液,取0.1mL分别均匀涂布于已制备好的2216E平板培养基上,用无菌镊子夹取抗菌药物纸片(氨苄青霉素、庆大霉素、恩诺沙星、环丙沙星、先锋霉素Ó、麦迪霉素、四环素、氯霉素、链霉素、复方新诺明、土霉素、氧哌嗪青霉素、红霉素、新霉素)平贴并轻压使其紧贴平板表

面eh,6

5

8

7

7

2 结 果

2.1 副溶血性弧菌Bh-06的鉴定

2.1.1 副溶血弧性菌Bh-06的形态及培养特征的观察 ¹副溶血性弧菌Bh-06涂片,经革兰染

色镜检观察,革兰染色菌为阴性弧菌,两端钝圆;º副溶血性弧菌Bh-06在弧菌强选择性培养基TCBS平板上形成0.5~1.0mm的菌落,略隆起,浑浊,因不发酵蔗糖而呈蓝色或蓝绿色菌落;»副溶血性弧菌Bh-06在胰蛋白胨平板上,在浓度大的地方,出现锯齿状,单个菌落圆形,隆起,表面光滑湿润,稍浑浊不透明,不产生色素;¼副溶血性弧菌Bh-06生长在液体培养基表面形成菌膜,需氧性明显。

2.1.2 Biolog全自动细菌鉴定仪鉴定结果 副溶血性弧菌Bh-06经Biolog全自动细菌鉴定仪鉴定,菌株为副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolytic-us),分析结果SIM值为0.95,具有较高的可信度。

2.2 副溶血弧性菌Bh-06生长曲线的测定

图1 副溶血性弧菌Bh-06的生长曲线

Fig.1 GrowthcurveofVibrioparahaemolyticusBh-06

由图1可见,副溶血性弧菌Bh-06在第5小时进入对数早期,对数期一直延续到第25小时,培养液中的菌液浓度达到最高值。以后持续一个稳定期,最后菌液浓度缓慢下降。2.3 南美白对虾攻毒试验结果

由表1可以看出,副溶血性弧菌Bh-06在[email protected]/mL浓度时可引起南美白对虾发病,而且浓度越高,病症越严重。将死亡的虾体进行匀,平板,6

70 微 生 物 学 杂 志 30卷

弧菌仍为优势菌群,经革兰染色和一系列生化实验确定为副溶血性弧菌Bh-06。

表1 南美白对虾攻毒试验结果

Table1 PoisonattackingexperimentresultsonSAWP(Penaeusvannamei)

组别12345对照

试验用虾尾数菌液浓度/(cfu#mL-1)

[1**********]0

[email protected]@[email protected]@[email protected]

死亡数2351000

死亡率/%

38.38.51.7000

发病尾数

18155400

发病症状

附肢发红,不动,或沿水箱壁漫游,所有病虾均空胃,肝胰腺肿大,不摄食附肢发红,病症较轻附肢发红,病症较轻附肢发红,病症很轻未见明显变化未见变化

2.4 副溶血性弧菌Bh-06的敏感性试验 副溶血性弧菌Bh-06的14种药敏试验结果

见表2。

表2 副溶血性弧菌Bh-06的14种药敏试验结果

Table2 14kindsofmedicinessensitivityexperimentresults

againstV.parahaemolyticusBh-06

药物氨苄青霉素恩诺沙星先锋霉素Ó四环素链霉素土霉素

反应性+-+++++-药物庆大霉素麦迪霉素复方新诺明氧哌嗪青霉素新霉素

反应性+-+++++

浓度越高,病症越严重。从死亡的虾体内可以分离到Bh-06,说明该菌株是病原菌。副溶血性弧

菌Bh-06在培养25小时达到稳定期,因此生产上可在这个时间段前用药,可以更好地控制该菌的大量繁殖,减少病原菌对对虾的感染。通过对该株菌进行药敏试验,副溶血性弧菌Bh-06对生产上常用的麦迪霉素、恩诺沙星、土霉素3种抗菌药物产生了较强的抗药性,而对氧哌嗪青霉素产生高度的敏感性,因此可考虑作为治疗药物。 弧菌是一种条件致病菌,很多研究表明弧菌引起对虾发病与养殖环境中的弧菌数量有关。曹立业认为水体内弧菌总数高于[email protected]/

[5]

mL时对虾会发病;曹琛指出少量弧菌存在于养殖环境中对虾并不一定发病,当养殖环境恶化,对虾体内抗病能力下降时,弧菌就会大量繁殖蔓延,从而引发各种疾病和继发感染。因此,生产上定期监测养虾池中弧菌的数量变化,对预防虾病发生具有重要意义。参考文献:

[1] RobinS.Micrologsystemrelease4.2userguide[M].CACU-SA:Hayward,2004.

[2] 倪纯治,林燕顺,叶德赞,等.海水养殖池的几种致病菌生态

[J].台湾海峡,1995,14(1):73-79.

[3] 陶保华,胡超群,任春华.副溶血性弧菌对斑节对虾和日本

对虾的致病力研究[J].中国水产科学,2000,7(3):117-119.

[4] 曹立业.关于养虾池水质监测指标的建议[J].水产科学,

1996,15(6):22-23.

[5] 曹琛,黄金勇,李举鹏,等.TCBS培养基在虾病防治监测中

[,(.

[4]

4

注:/+++0表示高度敏感,抑菌圈大于16mm;/++0表示

中度敏感,抑菌圈10~15mm;/+0表示低度敏感,抑菌圈7~10mm;/-0表示耐药,抑菌圈小于7mm

由表2可见,副溶血性弧菌Bh-06对生产上常用的麦迪霉素、恩诺沙星、土霉素3种抗菌药物产生了较强的抗药性,因此以上3种药物不宜作为该病原菌的防治药物。而对氧哌嗪青霉素产生高度的敏感性,可考虑作为治疗药物。

3 讨 论

TCBS是一种选择性培养基,通过致病菌的分离与培养试验,TCBS培养基上有大量黄色和绿色菌落生长,在显微镜下观察到短杆状或弧状细菌,初步可确定为弧菌。本实验从患病对虾肝胰腺组织和肠道中分离到1株弧菌Bh-06,通过细菌自动鉴定仪鉴定为副溶血性弧菌。该菌在[email protected],6


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